Dr hab. Marcin Michalak z Uniwersytetu Warmińsko Mazurskiego (UWM) wraz Prof. Pawłem Chmielarzem z Instytutu Dendrologii PAN i współpracownikami szukali skutecznych metod, które pozwolą sklonować najstarsze polskie dęby. Ostatnio skupili się na dębach szypułkowych (Quercus robur L.) w różnym wieku (mających do 800 lat). Oceniali ich potencjał regeneracyjny podczas metody określanej jako "mikrorozmnażanie".

"Badania nad możliwością wykorzystania kultur in vitro do zachowania zasobów genowych najstarszych polskich dębów można określić jako maraton - a nie sprint, ponieważ trwały one wiele lat" - mówi Nauka w Polsce dr hab. Marcin Michalak z Katedry Fizjologii, Genetyki i Biotechnologii Roślin UWM, który wraz z prof. Chmielarzem był pomysłodawcą badań. Zastrzega, że chodzi o prace nad zachowaniem drzew, które rosną bardzo powoli, dlatego "trudno spodziewać się w ich przypadku szybkich rezultatów".

Dlaczego właściwie naukowcy chcą klonować najstarsze dęby?

"Chodzi o badania, które mogą umożliwić ochronę jednych z najstarszych i cennych kulturowo drzew rosnących w Polsce" - podkreśla dr Michalak. I dodaje, że poza cisami - to właśnie dęby są jedną z najstarszych grup drzew rosnących w Polsce. Pojawiają się też w legendach, m.in. tej związanej z początkiem Polski.

"Drzewa te są interesujące również ze względów poznawczych" - zauważa badacz. "Nurtujące jest choćby pytanie: dlaczego akurat tym osobnikom udało się przetrwać setki lat? Co więcej, rosły one w zmieniających się warunkach środowiska - a pozostają w dobrej kondycji. Prawdopodobniej posiadają więc jakiś zestaw cech związanych z długowiecznością i zdolnością do adaptacji. Znajomość tych cech - to byłaby bardzo cenna wiedza".

"Pamiętajmy, że część tych drzew dobiega kresu życia. To wszystko sprawia, że warto zachować ich klony" - podkreślił.

"Jedną z metod zachowania zasobów genowych ex situ (to znaczy poza miejscem, w którym występują naturalnie - przyp. redakcja) jest hodowla klonów w warunkach in vitro (według określonych procedur, w laboratorium - przyp. redakcja), np. przy obniżonej temperaturze hodowli. Ta metoda jest powszechnie wykorzystywana dla cennych klonów w ogrodnictwie, np. porzeczek. Zależało nam także na opracowaniu metody wprowadzenia do kultur in vitro wszystkich dębów rosnących w Polsce, niezależnie od ich wieku. Dzięki temu metodę tą będzie można wykorzystać w przyszłości, np. do stworzenia lasu klonów drzew doborowych w Lasach Państwowych" - sugeruje.

Dlaczego naukowcy testują taką metodę do rozmnażania dębów?

Czy nie można do tego wykorzystywać żołędzi albo rozmnażać wegetatywnie - tak, jak rośliny ogrodowe, np. przez robienie tradycyjnych sadzonek? Dr Michalak tłumaczy, że żołędzie jest to potomstwo drzew matecznych, tak więc posiadają inny genotyp. "Przez co nie wiemy, jakie cechy odziedziczą, po którym z rodziców. Zresztą nie wszystkie najstarsze dęby owocują. Dodatkowo wraz z wiekiem dębów jakość wytwarzanych przez nich żołędzi spada. A maksymalny czas przechowywania żołędzi dobrej jakości to są 3 lata. W przypadku dębów nie możemy też zastosować typowych metod do rozmnażania wegetatywnego drzew, takich jak sadzonkowanie czy odkłady. Tkanki dębów cechują się słabą zdolnością do ukorzeniania, również szczepienie nie sprawdza się na większą skalę poprzez słabą wydajność tego zabiegu".

Naukowcy dopracowali metodę, która pozwala na sklonowanie w warunkach in vitro poprzez zastosowanie metody mikrorozmnażania pędów odroślowych. Metoda ta w skrócie polega na wprowadzeniu do kultur in vitro fragmentu pędu wraz ze stożkiem wzrostu. Dzięki czemu taki pęd posiada nie tylko zdolność do wzrostu w kulturach in vitro, ale również ma zdolność do wytwarzania kolejnych pędów. Pozwala to na tworzenie w warunkach in vitro kolekcji klonów dębów szypułkowych w różnym wieku.

Dokonali tego, wykorzystując materiał pobrany z najstarszych polskich dębów, a sukcesem było to, że wszystkie 67 badanych okazów udało się rozmnożyć w warunkach in vitro, nawet 800-letnie dęby szypułkowe - mówi dr hab. Marcin Michalak. Aż takiej skuteczności metody naukowcy na początku nie oczekiwali.

Wcześniej możliwe było sklonowanie in vitro maksymalnie 300-letnich dębów, zatem opracowana metoda przesunęła tę granicę wieku o ponad 500 lat.

W pracy opublikowanej na łamach "Plants" badacze nawiązują do wyników uzyskanych przez hiszpańską badaczkę, prof. A.M. Vietez i jej współpracowników, którzy metodę mikrorozmnażania w warunkach in vitro zastosowali wobec 70-300 letnich dębów szypułkowych. Dlaczego hiszpańskiemu zespołowi nie udało się sklonować jeszcze starszych dębów? "Wydaje mi się, że problem mógł być związany z zastosowaną przez nich metodą sterylizacji tkanek przez wprowadzeniem ich do kultur in vitro" - odpowiada dr hab. Marcin Michalak.

Jak wyglądały badania prowadzone w Polsce?

Na początku, korzystając z technik alpinistycznych, badacze zebrali zdrewniałe gałęzie z 67 wybranych drzew. Gałęzie pocięto później na mniejsze fragmenty o długości ok. 25-30 cm i wstępnie oczyszczono.

Następnie pędy były uprawiane w doniczkach w temperaturze 25 st. C. Chodziło o uzyskanie tzw. pędów epikormicznych czyli przybyszowych. To był tzw. okres hodowli fitotronowej, podczas której zdrewniałe pędy umieszczono w pojemnikach z wilgotnym perlitem. Hodowla prowadzona była w określonych parametrach oświetlenia (16 godzin dnia/ 8 godzin nocy), w temperaturze 25 st. C i przy wysokiej wilgotności powietrza (80-90 proc).

Jak tłumaczy serwisowi Nauka w Polsce dr Michalak, uzyskanie sterylnych kultur in vitro jest niezwykle trudne. "Dotyczy to zwłaszcza wiekowych drzew, u których liczne mikroorganizmy występują nie tylko na powierzchni, ale mogą też wnikać do wnętrza, np. zasiedlać wiązki przewodzące i przestrzenie międzykomórkowe" - podkreśla naukowiec. Skuteczna inicjacja hodowli in vitro wymaga eliminacji wszystkich drobnoustrojów. "Dlatego, w przeciwieństwie do zespołu hiszpańskiego, w naszych badaniach znacznie więcej uwagi poświęciliśmy materiałowi zaraz po zbiorze" - relacjonuje naukowiec.

Zebrane zdrewniałe pędy były mechanicznie oczyszczane, a następnie traktowane podchlorynem sodu, który ma właściwości odkażające. Dodatkowo, aby zapewnić dobre przewodzenie wody i eliminację drobnoustrojów znajdujących się wewnątrz zdrewniałych pędów, "odpowietrzono" wiązki przewodzące, umieszczając dolne końce pędów we wrzącej wodzie. „Tak przygotowane zdrewniałe pędy pozwoliły nam uzyskać pędy odroślowe, które poddawane były dodatkowej sterylizacji przed wprowadzeniem do kultur in vitro” - podał dr hab. Michalak.

Naukowcy przetestowali kilka protokołów sterylizacji, wykorzystując różne związki. Najlepsze efekty uzyskali po zastosowaniu chlorku rtęci. „Dopiero po zastosowaniu tego związku byliśmy w stanie uzyskać liczne sterylne kultury in vitro z najstarszych dębów rosnących w Polsce” - podkreślił.

Po sterylizacji pędów odroślowych naukowcy umieszczali je w warunkach in vitro na pożywce Woody Plant Medium (WPM), wzbogaconej w hormony, jak np. np. 6-benzyloaminopuryna (BAP), kwas indolilo-3-octowy (IAA) czy kwas indolilo-3-masłowy (IBA).

Po uzyskaniu pędów z dobrze wykształconymi liśćmi, kolejnym etapem było rozpoczęcie procesu ukorzeniania na pożywkach ukorzeniających. Wzrost roślin w warunkach in vitro jest możliwy dzięki zastosowaniu odpowiednich pożywek, które są mieszaniną roztworów zawierających niezbędne makro- i mikroelementy oraz dodatki, jak witaminy, aminokwasy, cukry (jako źródło energii) oraz regulatory wzrostu.

Jaki był wpływ systemu hodowli oraz składu makro i mikroelementów na wzrost pędów in vitro? "Początkowo pokładaliśmy duże nadzieje w półpłynnym systemie hodowli z wykorzystaniem bioreaktora. Jest to stosunkowa nowa metoda, która jest coraz powszechniej wykorzystywana do prowadzenia kultur pędowych w warunkach in vitro" - odpowiada dr hab. Marcin Michalak. Jednak najlepszy wynik, czyli najdłuższe pędy i największą liczbę pędów w hodowli in vitro naukowcy uzyskali, kiedy pędy umieszczano horyzontalnie na pożywce WPM. Dokładny jej skład został opracowany przez McCown’a i Lloyd’a w 1981 r.

„Jeśli chodzi o skład pożywki, to tutaj widzę jeszcze obszar do dalszych badań, pozwalających na jego dopracowanie, które umożliwi dłuższe przetrzymywanie pędów w warunkach in vitro i jeszcze skuteczniejsze ich ukorzenianie” - uważa dr hab. Marcin Michalak. Dodaje, że takie badania są czasochłonne i wymagają współpracy i wysiłku wielu osób, przede wszystkim przy dbaniu o utrzymanie pędów we właściwej kondycji w kulturach in vitro. „Ale jestem pełen nadziei i bardzo się cieszę z dotychczasowych wyników” - podsumowuje.

Ostatnim etapem było przywrócenie siewek (posiadających dobrze wykształcony system korzeniowy) do wzrostu w glebie poprzez aklimatyzację.

Jak podkreślili badacze, podczas trudnego etapu aklimatyzacji i przenoszenia roślin do warunków ex vitro dochodzi do dużych strat wśród wyhodowanych sadzonek. "W in vitro są bardzo korzystne warunki: wysoka wilgotność, brak patogenów itd. Kiedy sadzonki wracają do gleby, to ponownie muszą przyzwyczaić się do współżycia z innymi organizmami" - opowiada Michalak.

Wszystkie badane wiekowe dęby pomnikowe udało się wprowadzić do warunków in vitro. Natomiast problemem na obecnym etapie badań jest ukorzenienie i powtórna aklimatyzacja siewek do warunków ex vitro (etapów mikrorozmnażania, które nie mają miejsca in vitro, czyli w próbówce w laboratorium – PAP). „Wszystkie z badanych najstarszych drzew wprowadziliśmy do warunków in vitro, natomiast nie wszystkie ukorzeniliśmy” - doprecyzował dr Marcin Michalak.

Już teraz opracowana metoda pozwoliła rozmnożyć (uzyskać kompletną sadzonkę z pędem i korzeniem) kilka z testowanych na początku 21 dębów pomnikowych, w tym - jeden z najstarszych w Polsce dąb: Rus z Rogalina. Spośród dębów Rogalińskich, noszących imiona legendarnych władców państw słowiańskich, Czech jest już martwy, a w wypadku Lecha obserwuje się ciągły, pogarszający się stan zdrowia. Czteroletnią sadzonkę dębu Rus (dwa lata in vitro + dwa lata ex vitro w pojemniku), mierzącą ok. dwóch metrów, posadzono w 2019 r. w Rogalinie w tamtejszym parku obok drzewa matecznego. Ciekawostką jest to, że dąb zaczął wydawać pierwsze żołędzie już w wieku sześciu lat. „Zazwyczaj dęby owocują w wieku około dwudziestu lat. Wskazywałoby to na to, że zachował tzw. 'pamięć wieku'" – wyjaśnił dr hab. Marcin Michalak.

Dla efektywności tworzenia pędów istotny jest genotyp - mówią autorzy badania. Mówiąc w uproszczeniu oznacza to, że różne drzewa "mają różną zdolność do namnażania pędów w warunkach in vitro" - mówi dr Michalak.

Ta zdolność do namnażania nie jest skorelowana z wiekiem: kilka najstarszych dębów miało większą zdolność do namnażania pędów w warunkach in vitro, niż osobniki znacznie młodsze (np. 20-, 70-, 100- czy 300-letnie).

Jak zaznacza dr Michalak, w literaturze naukowej można znaleźć informacje, że drzewa wraz z wiekiem tracą zdolność do regeneracji w warunkach in vitro, co nie znalazło potwierdzenia w polskich badaniach. „Być może drzewa te przetrwały setki lat, ponieważ posiadają jakąś wspólną genetyczną cechę" - sugeruje.

Potrzeba dalszych badań

Dendrolog z UWM uważa, że więcej uwagi warto poświęcić najstarszym dębom, które "mogą posiadać wiele cennych informacji".

"Może dzięki temu uda się nam poznać tajemnicę ich długowieczności oraz zdolności do adaptacji do zmieniających się warunków środowiskowych. Dzięki temu w przyszłości może uda się wyhodować las odporny na zmiany klimatyczne, a jeszcze dalej - hodować drzewa na innych planetach" - mówi.

I podkreśla, że takie pomysły to nie jest tematyka science fiction: "NASA prowadzi obecnie badania nad hodowlą roślin in vitro w stanie nieważkości".

Jak dodaje, naukowcy muszą śpieszyć się ze swoimi badaniami, gdyż czas życia wielu wiekowych dębów dobiega końca. Wśród drzew liściastych w Europie znajdują się monumentalne dęby szypułkowe (Quercus robur L.), których wiek ocenia się na około 1000 lat - np. dąb Granit w Bułgarii, Kongeegen w Danii, dąb Stelmužė na Litwie i dąb większy w Anglii. W Polsce najstarszą grupą drzew są dęby szypułkowe, których wiek waha się od 500–800 lat.

Liczba największych i najstarszych drzew na świecie stale spada ze względu na zmiany klimatu, zanieczyszczenie powietrza, ale także np. niewłaściwe prace konserwatorskie czy ataki wandali.

"Niestety oprócz przyczyn naturalnych pojawiały się także akty wandalizmu" - przypomniał naukowiec. W 2010 r. nieznani sprawcy podpalili dąb Napoleon, w 2014 r. spłonął dąb pomnikowy Chrobry. W 2019 r. podpalony został Mieszko I - najstarszy dąb w województwie mazowieckim, którego wiek jest szacowany mniej więcej na 600 lat.

Metodę klonowania dębów opracowano przy zaangażowaniu pracowników Pracowni Biologii Rozmnażania i Genetyki Populacyjnej (dr. Szymon Kotlarski, Magdalena Sobczak, Paulina Pilarz, Agat Obarska i Danuta Szymańska), we współpracy z dr. Dymitrijem Kulaginem z Instytutu Lasu w Homlu na Białorusi. Badania współfinansowała GDLP w Warszawie.

Anna Mikołajczyk-Kłębek, Nauka w Polsce

amk/ zan/